Το Κυτταρογενετικές μελέτες
Το

Κυτταρογενετικές μελέτες

Οι κυτταρογενετικές μελέτες είναι ένας συνδυασμός μεθόδων για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ του φαινομένου της κληρονομικότητας και της δομής των κυττάρων (ειδικά των δομών του κυτταρικού πυρήνα). Οι κυτταρογενετικές μελέτες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη βιοϊατρική εργασία, καθώς βοηθούν στην αποσαφήνιση των γενετικών χαρακτηριστικών, της μεταβλητότητας (βλέπε), της προέλευσης και της εξέλιξης των ζωντανών όντων.

Το αντικείμενο της κυτταρογενετικής έρευνας είναι κυρίως τα χρωμοσώματα του ανθρώπου, των ζώων και των φυτών, τα οποία είναι ειδικά για κάθε είδους ιδιότητες (αριθμός, μέγεθος, δομικά χαρακτηριστικά) και αποτελούν τον χαρακτηριστικό καρυότυπο για τον οργανισμό. Ως εκ τούτου, οι μέθοδοι κυτταρογενετικής έρευνας χρησιμοποιούνται στην κατασκευή φυσικών ταξινομήσεων ζώντων οργανισμών.

Στις κυτταρογενετικές μελέτες, ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στην πολυπλοειδία, φαινόμενο που συνδέεται με πολλαπλή αύξηση στον αριθμό των χρωμοσωμάτων, συνοδευόμενη από την εμφάνιση ορισμένων νέων ιδιοτήτων (αύξηση του συνολικού μεγέθους, γεύση φρούτων και λαχανικών, βιωσιμότητα στα φυτά κλπ.). Η ανάπτυξη του προβλήματος της πολυπολιδίας έχει πρακτική σημασία στη γεωργία , στην επιλογή των φυτών και των ζώων.

Με τη βοήθεια κυτταρογενετικών μελετών, ανιχνεύονται αλλαγές στα χρωμοσώματα που μεταδίδονται στους απογόνους και που με κάποιο τρόπο επηρεάζουν τα σημάδια του οργανισμού. Μελετούν επιβλαβείς χρωμοσωμικές αναδιατάξεις, απώλεια, απώλεια ή προσθήκη μεμονωμένων χρωμοσωμάτων ή περιοχών χρωμοσωμάτων. Επιτρέπουν τον εντοπισμό της εμπλοκής του κληρονομικού παράγοντα στην εμφάνιση ορισμένων ανθρώπινων ασθενειών (βλέπε κληρονομικές ασθένειες), συμπεριλαμβανομένων αναπτυξιακών διαταραχών, προδιάθεσης για κακοήθη νεοπλάσματα κλπ. Οι κυτταρογενετικές μελέτες έχουν οδηγήσει σε σωστή κατανόηση της φύσης της ασθένειας ακτινοβολίας .

Το

Με τη βοήθεια κυτταρογενετικών μελετών διαπιστώθηκε, για παράδειγμα, ότι στους πυρήνες των κυττάρων διαφόρων ιστών και οργάνων, αλλά μόνο στις γυναίκες, εμφανίζονται έντονες κηλίδες με ειδικούς σχηματισμούς χρωμάτων, τα λεγόμενα σώματα Barra ή σεξουαλική χρωματίνη . Αποδείχθηκε ότι η σεξουαλική χρωματίνη εμφανίζεται σε πολλά ζώα και σε ανθρώπους. Η ανακάλυψη της σεξουαλικής χρωματίνης επέτρεψε να προσδιοριστεί το φύλο ενός ατόμου σε κυτταρικό επίπεδο (αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την ιατροδικαστική ιατρική), να διαγνωστεί το φύλο του εμβρύου στα πρώιμα στάδια της εγκυμοσύνης και να επιλυθούν ορισμένα άλλα θέματα της ιατρικής πρακτικής.

Δείτε επίσης Γενετική, Κληρονομικότητα.

Οι κυτταρογενετικές μελέτες είναι μια μικροσκοπική μελέτη των συγκεκριμένων κυτταρικών δομών που καθορίζουν τις διαδικασίες κληρονομιάς και ανάπτυξης.

Οι κυτταρογενετικές μελέτες χρησιμοποιούνται ευρύτερα στην κλινική ιατρική. Η πιο απλή, γρήγορη και προσιτή μέθοδος κυτταρογενετικής ανάλυσης είναι η μελέτη της χρωματίνης φύλου.

Η σεροχρωματίνη είναι ένα σώμα χρωματίνης, το οποίο απουσιάζει στα αρσενικά, και στις γυναίκες ανήκει σε πυρηνικό φάκελο.

Έτσι, αυτό το σώμα μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα κυτταρολογικό σύμβολο του σεξ και σε αυτό το πλαίσιο έχει λάβει το όνομα της σεξουαλικής χρωματίνης.

Οι διαστάσεις των σωμάτων σωματικής χρωματίνης στον άνθρωπο κυμαίνονται από 0,7 έως 1,2 μικρά, το σχήμα τους μπορεί να ποικίλει (Σχήματα 1 - 3). Στις γυναίκες, η σεξουαλική χρωματίνη προσδιορίζεται κατά μέσο όρο στο 40% των πυρήνων (Σχήμα 4). Δημιουργείται από ένα από τα Χ χρωμοσώματα του θηλυκού καρυότυπου, το οποίο βρίσκεται σε ανενεργή, σπειροειδή κατάσταση. Η σεξουαλική χρωματίνη μπορεί να ανιχνευθεί στα κύτταρα του στοματικού βλεννογόνου, του κόλπου και της ουρήθρας, καθώς και στα κύτταρα του αίματος, στο δέρμα βιοψίας, στον καλλιεργημένο ιστό ενηλίκων, στον εμβρυϊκό ιστό, στα νευρικά κύτταρα.

Η πιο απλή και βολική μέθοδος για τον προσδιορισμό της χρωματίνης φύλου στα κύτταρα του στοματικού βλεννογόνου προτείνεται από την Thiries και τελειοποιείται από τον Sanderson. Για τη μελέτη, η απόξεση λαμβάνεται από την βλεννογόνο μεμβράνη των μάγουλων. Το υλικό μεταφέρεται σε ολίσθηση, ξηραίνεται στον αέρα και για 10 λεπτά. σταθεροποιείται σε μεθυλική αλκοόλη. Το χρώμα παράγεται με μια σταγόνα φρεσκοδιαλυμένης ακετοκασίνης (1 g συνθετικής ορεσίνης διαλύεται σε 45 ml παγόμορφου οξικού οξέος, θερμαίνεται μέχρι βρασμού και διηθείται μετά από διήθηση, 55 ml αποσταγμένου νερού προστίθενται σε 45 ml διηθημένου διαλύματος και αυτό το μείγμα διηθείται επανειλημμένα). Όταν είναι μικροσκοπικά με στόχο εμβάπτισης, υπολογίζεται ο αριθμός των θετικών σε χρωματίνη πυρήνων ανά 100 κύτταρα.

Το

Η μελέτη της σεξουαλικής χρωματίνης χρησιμοποιείται για τον κυτταρολογικό προσδιορισμό του φύλου, την ταχεία και έγκαιρη διάγνωση ασθενειών που συνδέονται με τις εκτροπές των σεξουαλικών χρωμοσωμάτων (ιδιαίτερα σύνδρομα Klinefelter, σύνδρομα Shereshevsky-Turner, κλπ.), Χαρακτηριστικά ορισμένων φυσιολογικών διεργασιών (ειδικότερα του έμμηνου κύκλου) τοπικές τακτικές μιας σειράς παθολογικών διεργασιών και, πρώτον, κακοήθων νεοπλασμάτων, διασαφήνιση της επίδρασης ορισμένων θεραπευτικών μεθόδων και παραγόντων (αντιβιοτικά, κορτικοστεροειδή, ισοστατικά φάρμακα).

Οι μέθοδοι κυτταρογενετικής ανάλυσης περιλαμβάνουν επίσης τη μελέτη ενός καρυότυπου (βλ.).

Έχει διαπιστωθεί ότι το ανθρώπινο σύνολο χρωμοσωμάτων αποτελείται από 46 χρωμοσώματα (23 ζεύγη), δύο χρωμοσώματα του φύλου (XX - σε μια γυναίκα, XY - σε έναν άνθρωπο), 22 ζεύγη αυτοσωμάτων (Εικόνα 5) και είναι εξαιρετικά σταθερό στα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος.

Ανάλογα με το μήκος των χρωμοσωμάτων και τη θέση του κεντρομερούς τους, ολόκληρο το σύνολο χρωμοσωμάτων χωρίζεται σε 7 ομάδες - Α, Β, Γ, Δ, Ε, ΣΤ, Γ.

Για να μελετηθεί η χρωμοσωμική πρόσληψη ενός ατόμου (καρυότυπος), χρησιμοποιούνται μέθοδοι για την καλλιέργεια λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος, ινοβλαστών εμβρυϊκών ιστών, καλλιέργειας κυττάρων δερμάτων και μιας άμεσης μεθόδου για τον προσδιορισμό του χρωμοσωμικού σε κύτταρα μυελού των οστών.

Ο GK Khrushchev (1935), ένας σοβιετικός βιολόγος, ανέφερε για πρώτη φορά την επιτυχημένη καλλιέργεια μη διαχωριστικών λευκοκυττάρων. Το 1958, ο P. Nowell πρότεινε τη χρήση της φυτοαιμαγλουτινίνης (PHA) για να διεγείρει τη διαίρεση των λευκοκυττάρων σε μια ουσία που απομονώθηκε από όσπρια. Η καλλιέργεια λευκοκυττάρων διεξάγεται με τροποποιημένη και βελτιωμένη τεχνική. 10 ml φλεβικού αίματος που παρελήφθησαν στείρα σε δοκιμαστικό σωλήνα με ηπαρίνη (1 ml αμφολυμένης ηπαρίνης αραιωμένης 20 φορές με διάλυμα Hanks), τοποθετήθηκαν για 30-40 λεπτά. στο ψυγείο. Κατόπιν, 0,7-1 ml διαλύματος ζελατίνης 10% προστίθεται στο αίμα με αποστειρωμένο τρόπο (στο κουτί) για να επιταχυνθεί η καθίζηση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Μετά το διαχωρισμό του αίματος, το πλάσμα αναρροφάται και τοποθετείται σε αποστειρωμένη φιάλη. Στο πλάσμα, το μέσο 199 ή το μέσο Eagle προστίθεται με ρυθμό 1,5 ml μέσου ανά 1 ml πλάσματος.

Για τη διέγερση της μιτωτικής δραστηριότητας των λευκοκυττάρων, 0.2 ml ΡΗΑ προστίθενται στο μίγμα. Το προκύπτον αιώρημα κυττάρων τοποθετείται σε θερμοστάτη στους t ° 37 ° για 72 ώρες. 2-3 ώρες πριν από τη σταθεροποίηση για κάθε φιαλίδιο (ένα εναιώρημα καλλιέργειας εμφιαλώνεται σε 1,5-2 ml σε αποστειρωμένες φιάλες τύπου πενικιλλίνης) προσθέστε 0,5-0,75 μg κολχικίνης (διάλυμα εργασίας κολχικίνης: 10 μg ανά 1 ml αποσταγμένο νερό) και να συνεχίσει την καλλιέργεια. Ακολούθως, οι καλλιέργειες φυγοκεντρούνται επί 5 λεπτά. σε 800 σ.α.λ. Το υπερκείμενο αποστραγγίζεται και προστίθενται 3-5 ml διαλύματος κιτρικού νατρίου 0,95% θερμασμένου σε t ° 37 °, το οποίο προκαλεί διόγκωση των κυττάρων. Σε ένα υποτονικό διάλυμα, τα κύτταρα διατηρούνται για 15 έως 30 λεπτά, μετά το οποίο απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό, προστίθεται ήπια προσθήκη σταθεροποιητή (3 μέρη απόλυτης αλκοόλης + 1 μέρος παγόμορφου οξικού οξέος) στο ίζημα, τοποθετείται σε ψυγείο για 15 λεπτά, στη συνέχεια φυγοκεντρείται και αλλάξτε το συγκρατητήρα. Για απολιπανθείσες πλάκες, εφαρμόζονται 1-2 σταγόνες κυτταρικού εναιωρήματος και ξηραίνονται πάνω σε φλόγα ή αναφλέγονται με σταθεροποιητή (παρασκευάσματα "καμένων"). Τα παρασκευάσματα χρωματίζουν το πολυχρωματικό μπλε Unna, ακετορκεΐνη ή Romanovsky. Το σύνολο χρωμοσωμάτων μελετάται με μικροσκοπία εμβάπτισης σε 100 μεταφάσεις.

Για να μελετηθούν τα χρωμοσώματα, χρησιμοποιείται επίσης μια άμεση μέθοδος για τον προσδιορισμό του σετ χρωμοσώματος σε κύτταρα μυελού των οστών: 1 ml φρεσκοαπορροφημένου μυελού των οστών τοποθετείται σε φιάλη με 30 ml μέσου 199 και 3 ml διαλύματος κολχικίνης (10 μg ανά ml). Τα περιεχόμενα της φιάλης αναταράσσονται ήπια ώστε να κατανέμονται ομοιόμορφα τα κύτταρα και κατόπιν φυγοκεντρούνται. Το υπερκείμενο αποστραγγίζεται και προστίθενται στο ίζημα 10 ml ενός διαλύματος 0.95% κιτρικού νατρίου θερμαινόμενο σε t ° 37 °. Τα κύτταρα επαναιωρούνται προσεκτικά και τοποθετούνται σε θερμοστάτη στους t ° 37 ° για 40-45 λεπτά. Μετά από αυτό, διεξάγεται εκ νέου η φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο αποστραγγίζεται και προστίθεται στο ίζημα ένας φρέσκος παρασκευαστής που περιέχει 3 μέρη μεθυλικής αλκοόλης και 1 μέρος πυκνού οξικού οξέος. Μετά από 10 λεπτά. το σφαιρίο επαναιωρείται και αφήνεται στον σταθεροποιητή για άλλα 20 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά, ο σταθεροποιητής αλλάζει πάλι και τα παρασκευάσματα παρασκευάζονται με τον ίδιο τρόπο όπως όταν σταθεροποιείται η καλλιέργεια λευκοκυττάρων αίματος.

Καρυότυπος μελέτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη διάγνωση των χρωμοσωμικών ασθενειών του ανθρώπου. Πρόσφατα, έχει εντοπιστεί μια ολόκληρη ομάδα χρωμοσωμικών ασθενειών που σχετίζονται με την παθολογία αμφότερων των φύλων και των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων (βλέπε Κληρονομικές Παθήσεις). Εκτός από την αλλαγή του αριθμού των χρωμοσωμάτων, μπορεί να υπάρχει παραβίαση της μορφολογίας τους. Έτσι, με χρόνια μυελογενή λευχαιμία παρατηρείται ένα ασυνήθιστα μικρό ακροκεντρικό χρωμόσωμα από το 21ο ζεύγος. Η εμφάνιση ανευπλοειδίας (αύξηση ή μείωση στον αριθμό των χρωμοσωμάτων, όχι πολλαπλάσιο του απλοειδούς αριθμού των χρωμοσωμάτων) μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστική εξέταση για το τελικό στάδιο της λευχαιμίας.

Οι κυτταρογενετικές μελέτες είναι πιο κοντά στην ογκολογία. Είναι πιθανό οι αλλαγές στο χρωμόσωμα που έχουν τεθεί κατά τη διάρκεια των διαδικασιών του καρκίνου να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη διάγνωσή τους. Για τις κυτταρογενετικές μελέτες, χρησιμοποιούνται μέθοδοι βραχυπρόθεσμης καλλιέργειας ιστού: η μέθοδος θρόμβου πλάσματος με επακόλουθες μελέτες υποκαλλιεργειών και η μέθοδος καλλιεργειών πρωτογενώς τρυψινοποιημένων εναιωρημάτων. Θα πρέπει να προτιμάται η πρώτη μέθοδος, δεδομένου ότι η δεύτερη απαιτεί μεγάλη ποσότητα ιστού για την παραγωγή εναιωρήματος κυττάρων ικανών να αναπαραχθούν.

Για να δημιουργηθούν οι πλέον ευνοϊκές μεταβολικές συνθήκες, χρησιμοποιείται ένας ανθρώπινος πλακούντας ορός χωρίς τοξικότητα, ένα εμβρυονικό εκχύλισμα 50% αποφθαρμένων ανθρώπινων εμβρύων, το οποίο παρασκευάζεται στο μέσο Eagle. Για την τοποθέτηση τεμαχίων στο γυαλί και την προσάρτηση μεγαλύτερου αριθμού κυττάρων χρησιμοποιώντας καλλιέργειες εναιωρήματος χρησιμοποιήστε ξηρή ομάδα ανθρώπινου πλάσματος IV, αραιωμένη πριν τη χρήση από το μέσο Eagle και ορό πλακούντα 1: 1. Μετά την εφαρμογή του εκφυτεύματος, προστίθεται ένα εμβρυονικό εκχύλισμα. Η καλλιέργεια πραγματοποιείται σε φιάλες Carrel (βλέπε Πολιτισμός των ιστών).

Το Σχ. 1. Χρωματίνη γεννητικών οργάνων με τη μορφή ωοειδούς (X1100).
Το Σχ. 2. Χρωματίνη γεννητικού τύπου τρίγωνο (XI100).
Το Σχ. 3. Φυσική χρωματίνη υπό μορφή πάχυνσης του πυρηνικού περιβλήματος (X1100).
Το Σχ. 4. Χρωματοχειρουργικός πυρήνας σε γυναίκα (X1100).
Το Σχ. 5. Κανονικός θηλυκός καρυότυπος (x1100).